ウリ科黄化病の新しい診断法

掲載日:2018年3月6日

当センターでは、県内に発生した植物の病気の診断を行っています。病気の発生は農作物の収穫に大きく影響しますが、なかでもカビや細菌が土壌中にあって病気を起こすものやウイルスが原因のものは、病気が発生してから使って効果のある農薬がほとんどありません。

そこでこれらの病気は、診断をしてその後の対応を検討しないと大きな被害となる可能性があり,病原体の診断同定が重要となります。

ウイルス診断法の1つである遺伝子診断法を用いて、キュウリ黄化ウイルス(BPYV)の新しい診断法を開発しましたので紹介いたします。

BPYVはオンシツコナジラミ(シルバーリーフコナジラミ、タバココナジラミによっては媒介されません)によって媒介され、日本では広くウリ科の野菜に被害をもたらします(写真)。このウイルスは植物の師部(維管束、通導組織)細胞に局在するため粒子数が少なく、電子顕微鏡による観察もコントラストが低く困難です。加えて、汁液接種できないため検定植物による生物検定ができません。それゆえ、これまでは確実な診断法がほとんどありませんでしたが、最近その検定感度の高さから注目されている遺伝子診断法であるPCR法による診断法が可能になりました。以下にその詳細を説明いたします。

PCR法はウイルスの塩基配列に合わせ、ウイルス塩基配列の特徴的な部分をDNAとして増幅するためのプライマーと呼ばれる短いDNA(20塩基対くらい)2種類(上流プライマーと下流プライマーと呼ばれる)を設計する必要があります。そのため、ウイルスの塩基配列がわかっていないと行えません。また、BPYVはRNAウイルスであるため逆転写反応(RT)-PCR法により診断する必要があります。この方法ではプライマーの設計とウイルスRNAの抽出法の二点が診断に重要となります。ウイルスRNAの抽出は近年様々な方法が開発されており、その中でも簡易で確実とされているグアニジン法を用いて行いました。プライマーの設計はPBYVのhsp70遺伝子部分に設計し、RT-PCRによる検出を行いました。

診断手順は、黄化病が疑われる罹病植物からグアニジン法でRNAを抽出します。そのRNA抽出液に下流プライマーを加えて逆転写反応を行い、ウイルスRNAの塩基配列をDNAに写し取ります。それに上流プライマーを加えて、PCR反応(2種類のプライマーにより目的とする塩基配列部分を増幅する)を行います。もし、植物にウイルスが含まれていれば、この反応により目的のDNAが増幅されてきます。ウイルスが含まれていなければ、この反応で目的のDNAは増幅されてきません。目的のDNAが増幅されているかどうかは、DNAを移動距離の違いにより大きさが判定できる寒天ゲル電気泳動を行うことで確認します(写真)。


キュウリ黄化病の病徴と遺伝子診断の寒天ゲルによるDNA電気泳動

写真はキュウリ黄化病の病徴とBPYV罹病メロンと健全メロンをPCR法による診断を行った電気泳動図です。

目的のDNA増幅産物はウイルスに感染している場合のみに認められ、この方法で診断が可能となりました。

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